近日，中科院植物所王雷研究組在Plant Physiology期刊上發(fā)表了題為“Rice CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 transcriptionally regulates ABA signaling to confer multiple abiotic stress tolerance"的研究成果。

該研究揭示了OsCCA1調控水稻適應鹽脅迫、干旱脅迫以及滲透脅迫的分子機制。其中，該研究使用了DNA親和純化測序技術（DAP-seq，DNA Affinity Purification Sequencing），鑒定了水稻生物鐘核心組分OsCCA1（Oryza sativa CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）調控的下游靶基因。

研究背景

生物鐘組分和脫落酸（Abscisic Acid，ABA）在調控植物生長發(fā)育和適應逆境脅迫過程中具有重要作用，但生物鐘組分是否參與ABA信號轉導，目前還不清楚。

研究材料

野生型水稻材料Dongjin（DJ）和OsCCA1功能缺失的突變體水稻（oscca1-L1和oscca1-L2）

研究結果

圖1. 使用DAP-seq方法，在全基因組水平上鑒定OsCCA1的直接結合靶點。

A. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關聯(lián)的基因數(shù)量及在全基因組的分布圖。

B. 使用MEME-CHIP分析OsCCA1結合的motif。

C和D. 使用EMSA驗證OsCCA1與SRZ1基因和OsPP2C09基因啟動子區(qū)的AAATATC motif的結合。

E. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關聯(lián)基因KEGG富集結果。

圖2. 使用RNA-seq發(fā)現(xiàn)OsCCA1調節(jié)ABA響應基因的表達。

A. oscca1-L1突變體與Dongjin (DJ)相比，上調和下調基因的數(shù)量。

B. 鹽脅迫條件下oscca1-L1中DEGs富集最多的15個GO term。

C. oscca1-L1突變體中DEGs與ABA響應基因重疊的基因數(shù)量。紅色和藍色箭頭分別表示上調和下調的基因。

D. 熱圖顯示（C）中19個ABA響應基因的轉錄豐度。

E. 鹽脅迫下oscca1-L1中的DEGs重疊的OsPYLs基因（左）、A類OsPP2Cs基因（中）、SnRKs/SAPKs基因（右）。紅色和藍色箭頭分別代表表達上調和下調的基因。

圖3. OsCCA1直接調控ABA響應基因的表達。

A. 比較DAP-seq鑒定的靶基因與RNA-seq結果中，oscca1突變體中已鑒定的DEGs，將重合的基因作為OsCCA1的直接靶基因。

B. OsCCA1靶基因的前15個富集的GO term。

C. OsCCA1直接激活的靶基因與A類OsPP2C基因重疊的基因。oscca1突變體與DJ中5個重疊基因的轉錄豐度。

D. 通過DAP-seq檢測的OsCCA1在OsPP108p（-2625 bp）上結合峰（重復1和重復2）和陰性對照（mock）。

E. OsbZIP46是OsCCA1的靶基因，而且是OsCCA1突變體中下調基因和鹽脅迫反應基因中的基因。

F. 通過DAP-seq檢測到的OsCCA1在OsbZIP46（-1263 bp）上結合峰(重復1和重復2)和陰性對照（mock）。

圖4. OsCCA1直接結合OsPP108和OsbZIP46的啟動子，并激活其轉錄。

A. 在正常條件和NaCl處理24小時后，Dongjin (DJ)和oscca1-Ls植株中OsPP108(左)和OsbZIP46(右)的轉錄水平。

B. 水稻原生質體瞬時表達實驗表明，OsCCA1可激活OsPP108和OsbZIP46的轉錄活性。

C和D.  ChIP-qPCR檢測顯示OsCCA1結合OsPP108和OsbZIP46的啟動子。

E和F. EMSA結果顯示OsCCA1直接結合OsPP108和OsbZIP46啟動子的rCBS基序。

結論

本研究使用DAP-seq和RNA-seq方法，揭示了水稻生物鐘核心組分OsCCA1通過直接結合和調控OsPP2Cs和OsbZIP46基因來協(xié)調ABA信號網絡增強水稻對多種非生物脅迫適應性的分子機制。該研究為生物鐘調控水稻耐逆性提供了新的理論依據，為研發(fā)具有多重抗逆性的水稻品種提供了設計育種的靶點和優(yōu)質遺傳資源。